威斯騰生物經過10多年的發展，獲得了上百種細胞株和四十余種原代細胞培養經驗，并建立了龐大的細胞庫及原代培養資料庫。細胞平臺有資深實驗員、規范的SOP操作文件，萬級凈化細胞房，這些條件為保質保量完成每個客戶的實驗提供了保障。 同時，威斯騰生物結合多年原代及傳代細胞培養經驗，結合平臺已有的技術優勢，建立了完善的體外藥篩實驗，并引進RTCA(Real-time cellular Analysis，實時無標記細胞記錄儀），在藥篩過程中，全程實時記錄細胞真實狀況，為藥篩提供最真實精準的實驗數據。

無菌操作注意事項

細胞培養一定要保持工作區的無菌清潔，先用紫外燈和臭氧殺菌1h，然后通風30min，操作前需要換細胞間專用拖鞋，雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒，穿上實驗服，戴上一次性口罩和帽子，操作時不能大聲說話，整個無菌操作都應該在酒精燈的周圍進行。

牛視網膜血管內皮細胞

（1）取成牛眼球，75%酒精消毒，取出周圍多余組織，用PBS洗3次，用PBS流水沖洗眼球3次。

（2）沿角膜緣剪開眼球，棄掉角膜、晶體、玻璃體等部分，將眼球后半部翻轉取出視網膜，將其剪碎平皿內加入適量0.25%的胰酶，在37℃培養箱中，采用分次消化，每次消化20min約8次。

（3）每次消化后取上清液，并加入等量的含10%的DMEM培養基，輕輕混勻，中和胰酶的消化，防止消化過度。用200目細胞過濾篩子過濾含細胞的混合液，最后將過濾后的細胞懸液1000rpm離心5min。離心后收集沉淀，用PBS再次重復離心3次。用細胞培養基將細胞沉淀重懸，接種于細胞培養瓶中培養，并每日觀察細胞的生長，接種后約4d后有少量細胞貼壁。

小鼠腦微血管內皮細胞分離

1.C57小鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后斷頭置于玻璃培養皿中，打開顱腔后取出全腦置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培養皿中解剖去除小腦、間腦(包括海馬)。

2. 隨后將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以吸除軟腦膜及腦膜大血管后置于新的含冷D-Hanks'液玻璃培養皿中，用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。
3. 用D-Hanks'液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培養液，用虹膜剪將其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%Ⅱ型膠原酶(含30 U/ml DNase I，1 ml/大腦)混勻后37 ℃水浴消化1.5 h。
4. 離心(1 000 rpm，5 min，室溫)，去上清液，加入20% BSA懸浮混勻后離心(1000 g，20 min，4 ℃)，去除中上層神經組織及大血管，保留底部沉淀。
5. 加入3 ml 2.5%胰酶消化液消化20min，加入等量含血清培養基終止消化，離心(1 000 rpm，8 min，室溫)，去上清液，加入2 ml DMEM培養液懸浮后鋪于經離心形成連續梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g，60 min，4 ℃)。
6. 離心(1 000 g，10 min，4 ℃)，靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗兩次(離心1 000 rpm，5 min，室溫)，去上清液。
7. 加入DMEM完全培養液(含20% FBS)懸浮后接種于涂布基質的35 mm一次性塑料培養皿(1.5 ml/培養皿，可接種1個培養皿/大腦)，置于37 ℃、5%CO2培養箱內靜置培養，12~24 h后換液，并加入1 ng/ml bFGF，隨后隔天換液。

細胞形態

腦微血管內皮細胞原代培養過程中，約24h即可貼壁生長，細胞呈長梭形生長緩慢。換液后細胞增殖明顯，出現以梭形為主的多種形態，5- 7d 70%-80%可融合達到傳代標準。

威斯騰實驗服務流程

威斯騰生物服務項目

【本平臺合作項目】
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